多光子显微镜 (MPM) 通过样本中荧光分子的非线性激发来对生物组织进行成像和分析。利用 MPM，两个或多个光子被同时吸收以激发荧光分子。与近红外 (nIr) 光激发相结合，它可以在高度分散的生物体中进行深度成像，使生命科学家能够更好地了解生物样本中的细胞结构和功能，体内和非侵入性。
在过去的 30 年里，MPM 的出现能够在高度分散的生物样品中以衍射极限分辨率进行深度成像MPM 使用 nIr 光 (>1100 nm) 进行荧光团激发。然而，大量生物样品在近红外线下的光传输通常不容易获得，并且感兴趣的生物样品通常为微米级。
许多商用分光光度计（测量紫外红外 (UV-Ir) 透过样品的光强度的光学系统）仅兼容厘米级的样品。康奈尔大学 IBM 应用与工程物理教授 Chris Xu 教授和研究小组的研究生 aaron Mok 需要一种解决方案，能够测量近红外光在更小的样本中的光传输，包括小鼠头骨、蚊子和果蝇角质层、大鼠硬脑膜和 Danionella 的皮肤，Danionella 是一种鱼类，其中包括生活在淡水中的最小脊椎动物。使用 MPM 的神经科学家对这些样本非常感兴趣。
“我们希望能够观察非常小的样本，”莫说。“您可以购买的现有分光光度计无法达到我们所需的微米级功能。
因此，我们着手构建一种新型仪器，使我们能够高精度地测量这些微小样品的光学特性。”
关键能力
l将AVxcelerate 传感器纳入其现有工具链，使采埃孚能够采用非顺序模式进行光散射模拟。
l光传输的定义能力。
l易于使用，包括访问在线论坛和 Zemax 知识库。
结果
l验证了使用单模光纤在组织光谱仪中隔离弹道光子的有效性。
l为五种微米级组织样本生成空间分辨透射图。
l为科学界提供了一个测量系统，有助于在极小规模的组织分析中获得准确的结果。
以新方式测量组织采样的弹道和总透射率
为了引导 MPM 显微镜成像，Mok 和 Xu 设计的光学系统需要观察三个关键测量：每个样品的弹道透射率，即穿过样品而不发生散射和吸收的光量；总透射率，即通过光的总量
样品不被吸收；以及局部微米级吸收和散射热点的识别。因此，莫克的项目需要检查光在各种样品中的散射方式，并创建可用于预测局部散射或吸收热点的透射图。他的目标是创建空间分辨透射图，揭示 911 nm 至 1624 nm 的宽光谱范围内五种样品类型的透射异质性，并报告 450 nm 至 1624 nm 光谱范围内的总透射率。
以前的组织分光光度计设计使用四个孔径的系统来测量弹道传输，两个在样品前面，两个在样品后面，以及一个照明源来测量弹道传输，如图 1 所示。此设置仅测量 ~cm 尺度的传输没有任何空间分辨的传输信息。
另一方面，Mok 和 Xu 提出的装置使用单模光纤 (SMF) 来隔离传输测量的弹道光子。该方法的优点是可以有效地隔离弹道光子，并使光聚焦到样品上，从而获得样品中约 25 um 光斑的透射率。然而，它需要一种模拟以前的四孔径设计的方法，以确保这种新方法能够准确测量与以前的设置相当的弹道传输。图 2 比较了两种设计。
图 1. 非顺序模式下双孔径设置的仿真设置。样品前面的两个孔径确保准直光束照亮样品。样本设置各向异性因子为 0.9，具有不同的散射平均路径。将样品后两个孔径的距离调整为 0.395° 或 0.914° 的接收半角，以排除散射光。探测器直接放置在第四个孔径之后。
Mok、Xu 和他们的团队使用 ansys Zemax OpticStudio 进行了仿真，以检查在接受半角为 0.395° 时使用双孔径设置以及在接受半角使用已发布的双孔径设置时非弹道光子的贡献。角度为 0.914°（图 3）。
“我们构建了一个简单且多功能的系统，用于测量可针对不同波长、空间分辨率和样本尺寸定制的样本的弹道和总透射率，并且通过实验结果和 OpticStudio 模拟验证了设置的准确性，”莫说。“利用它，我们可以分别使用与单模光纤和积分球耦合的光电探测器来测量弹道和总透射率。它允许使用更通用的设置来测量样品的光传输，而不仅仅是微型生物样品。”
图 2. (a) 基于 SMF 的微米级设计和 (B) 双孔径组织分光光度计设计的比较。
实现准确且可预测的微米级传输结果
SMF 方法的成功实施取决于准确、可靠的模拟。因此，OpticStudio 在团队成功证明 Mok 和 Xu 设计的可行性方面发挥了关键作用。特别是，OpticStudio 的非顺序模式使他们能够模拟生物组织中的散射，并使用工具来定义散射属性以及非各向同性、多方向射线的各向异性因子。
“使用我们在 OpticStudio 中创建的测量方法和模拟，我们验证了 SMF 可以有效隔离弹道光子。我们测量了已知光学特性的组织模型，然后将结果与理论预测和典型双孔径设置的 OpticStudio 模拟进行比较，”Mok 说。“我们还建立了一个处理管道来计算每个样本的传输图并从不同感兴趣区域提取传输数据。这导致实现了离体微型生物样品的空间分辨弹道和总透射测量，并报告了透射图以揭示所有样品的透射异质性。这种测量方法现在可以直接应用于其他样品。”
图 3. SMF 方法结果显示 OpticStudio 模拟数据 (sim) 和测量结果 (mea) 及其与理想地面实况的接近程度（黑实线）。
Mok 还认为 OpticStudio 的其他功能在关键方面提供了帮助。“OpticStudio 非常用户友好，这为我们的实验节省了大量时间，”他说。“参数太多，一开始很容易迷失。但经过一些培训后，OpticStudio 的使用变得非常直观。在线论坛和 Zemax 知识库文章非常有帮助。”
Mok、Xu 和他们的团队能够在 OpticStudio 中记录他们的发现并支持模拟的准确性和影响，从而能够在科学和商业光学界为他们隔离弹道光子的新方法提供令人信服的案例。通过为生物现象的微米级定量成像做出贡献，该团队的创新和发现无疑将带来更好地探索自然世界的新方法。
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